1 – ВВЕДЕНИЕ
Чума собак – системная
патология, возникающая у собак и прочих диких представителей семейства псовых. Ее
возбудитель – вирус собачьей чумы (CDV), морбилливирус из семейства
парамиксовирусов. Передается при прямом контакте, через вдыхание и путем
трансплацентарного переноса. Выводится с выделениями и секретом в острый
период. Вирус размещается в нервной системе, глазах, коже и легких.
Симптоматология разнообразна: изменения кожи, пищеварительной, нервной,
дыхательной систем и зрения. Смертность может составлять около 50% (среди
молодых и не привитых животных).
Диагноз ставится на основании
истории болезни, симптомов и лабораторных исследований. Одно из них –
определение антител.
2 – ПРИНЦИП ПРОВЕДЕНИЯ ТЕСТА
Данный комплект основан на
ферментном иммуноанализе с захватом. Краткое описание принципа проведения
теста:
Моноклональное антитело (Мат)
фиксируем на твердой опоре, пластина из полистирола. При добавлении сыворотки
собаки присутствующие в пробе ИгМ захватываются Маб, адсорбированным на
пластине. После промывания с целью удаления всего материала, не связанного из
пробы сыворотки, добавляют вирусный антиген (рекомбинантный нуклеокапсид). ИгМ
захватывает антиген только в то случае, если проба сыворотки содержит
иммуноглобулин М, специфичный к Cdv. После дополнительного промывания
добавляется Маб, конъюгированный пероксидазой, специфичный к белку
нуклеокапсида Cdv. После
промывания и добавления субстрата произойдет колориметрическая реакция, которую
можно измерить спектрофотометром.
Наличие цвета означает
наличие антител М против вируса в сыворотке собаки, а отсутствие цвета говорит
об отсутствии специфических антител.
3 СОДЕРЖАНИЕ КОМПЛЕКТА
В комплект входит:
• 1 формный планшет для микротитрования (96 лунок), покрытых
Маб, специфичным к ИгМ.
• 1 ампула с позитивной регуляцией, в готовом виде.
• 1 ампула с негативной регуляцией, в готовом виде.
• 1 ампула с конъюгатом пероксидазы 100Х.
· 1 бутылка рекомбинантного
вирусного антитела, концентрированного х10.
• 1 бутылка промывочного раствора, концентрированного х10.
• 1 бутылка с готовым к использованию субстратом.
• 1 бутылка с готовым к использованию стоп-раствором.
• 1 бутылка с готовым к использованию разбавителем.
4-МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ДЛЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ
• Внимательно изучить инструкцию по применению.
• Перед использованием выдержать все реагенты при комнатной
температуре (20°С - 25°С)
• Не перепутать реагенты или инструкции из разных комплектов или
наборов.
• Избегать загрязнения реагентов комплекта.
• Не использовать компоненты после истечения их срока годности.
· Не перепутать компоненты из
разных партий.
• В помещении для работы с образцами либо комплектом запрещается
есть, пить или курить.
• Для каждой пробы использовать новую пипетку.
При каждом использовании комплекта
систематически проводить тестирование позитивной регуляции и негативной
регуляции.
Хранение реагентов: комплект необходимо хранить при +4°С.
5 - ПРОЦЕДУРА ПРОМЫВКИ
Этапы промывки необходимо
осуществлять, используя автоматическую моющую машину либо многоканальное
капельно-дозировочное устройство, позволяющее дозировать 300 µл промывочного
раствора в каждую лунку. Помывку необходимо проводить следующим образом:
• Опорожнить содержимое пластины, быстро перевернув пластину во
избежание возможного смешения содержимого разных лунок
• Дозировать 300 µл промывочного буфера в каждую лунку.
• Аккуратно встряхнуть пластину, избегая попадания из одной
лунки в другую.
• Декантировать пластину и энергично постучать по лункам для
удаления промывочного буфера.
• Повторить процедуру столько раз, сколько указано в инструкции
к комплекту.
• Перед опорожнением содержимого пластины на последнем этапе
промывки убедитесь, что следующий реагент, который нужно будет добавить на
пластину, находится в готовом виде.
• Не нужно просушивать лунки дольше необходимого времени перед
дозированием реагента на следующем этапе.
• После последнего этапа промывки промакнуть пустые перевернутые
лунки чистыми бумажными полотенцами либо абсорбирующей бумагой для удаления
остатка промывочного буфера.
6 - ПОДГОТОВКА ПРОБ
Пробы сыворотки для
тестирования должны быть разбавлены в разбавителе в соотношении 1 / 100.
Для ТИТРОВАНИЯ рекомендуется
проанализировать два разных варианта разбавления, начиная с разбавления 1/100
для каждой пробы сыворотки, и заканчивая желаемой конечной концентрацией (как
правило, до 1,6400)
7 - ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ
Промывочный буферный раствор:
Разбавить одну часть
концентрированного промывочного буфера, поставляемого с комплектом, в 9 частях
дистиллированной либо деионизованной воды.
После разбавления промывочный
буферный раствор нужно хранить при +4°С.
Контрольная мультисыворотка
(позитивная и негативная регуляции):
Регуляции готовы к
использованию. Не разбавлять.
Приготовление конъюгата: готовить непосредственно
перед применением.
Разбавить разбавителем 1/100.
Необходимое и достаточное количество конъюгата для полной пластины составляет 110
μл конъюгата в 11 мл разбавителя. На полосу с 8 лунками – 10 μл конъюгата в 1
мл разбавителя. Каждый раз готовить только необходимое для анализа количество, оставшийся
конъюгат подлежит утилизации. Перед использованием раствор хорошо встряхнуть.
8 - ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ТЕСТА
• Перед началом проведения теста выдержать все реагенты и лунки,
которые понадобятся, в условиях комнатной температуры (минимум 30 минут), за
исключением конъюгата и рекомбинантного антитела.
• Добавить в лунки 100 µл позитивной и негативной регуляций в
две разные лунки. Для испытания добавить 100 μл каждого раствора пробы сыворотки
(подготовленного в соответствии с ранее упомянутыми указаниями) в оставшиеся
полоски на планшете. Рекомендуется тестировать (пробу и контрольную
мультисыворотку) в двойных лунках. Герметично закрыть пластину и выдерживать 15
минут при 37°С.
• Промыть 4 раза ранее описанным способом.
• Добавить 100 µл антигена, подготовленного в соответствии с
ранее приведенными указаниями, в каждую лунку. Герметично закрыть пластину и выдерживать
15 минут при 37°С.
• Промыть 4 раза ранее описанным способом.
• Добавить 100 µл конъюгата, подготовленного в соответствии с
ранее приведенными указаниями, в каждую лунку. Герметично закрыть пластину и
выдерживать 15 минут при 37°С.
• Повторить этапы промывания 4 раза в соответствии с ранее
приведенными указаниями.
• Добавить 100 µл раствора субстрата в каждую лунку. Выдержать
пластину 5 минут при комнатной температуре.
• Добавить 100 µл стоп-раствора в каждую лунку. Проверить
спектральную поглощательную способность в каждой лунке спектрофотометром при
450 нм.
9 - СЧИТЫВАНИЕ И РАСШИФРОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Считывание значений
спектральной поглощательной способности необходимо проводить при длине волны
450 нм.
Комплект Валидизация
Тест считается
действительным, если:
Результаты наблюдений за отрицательным контролем < 0,3
Результаты наблюдений за положительным контролем > 0,8
Расшифровка результатов
С помощью значения положительного
контроля необходимо следующим образом рассчитать пороговые значения:
Пороговое значение = результаты наблюдений за положительным
контролем х 0,2
При работе с пробами в
двойных лунках значение результатов наблюдений за пробой будет средним
значением по обеим лункам.
Отрицательные пробы: пробы с результатами наблюдений ниже
порогового значения.
Положительные пробы: пробы с результатами наблюдений выше
порогового значения.
Низкие-средние титры
(соответствующие значениям IFI 1/20-1/80). Такие пробы показывают значения наблюдений
между: 0,2 х результаты наблюдений за положительным контролем и 0,7 х
результаты наблюдений за положительным контролем
Высокие титры
(соответствующие значениям IFI > или равно 1/160). Такие пробы показывают значения
наблюдений более чем 0,7 х результаты наблюдений за положительным контролем.
Не смотря на хорошую
чувствительность и специфичность данного теста, все положительные пробы
необходимо подтверждать другими диагностическими методами. Доказательная
диагностика не должна основываться на результатах только одного теста. Данные
результаты нужно сопоставлять с прочими данными: история болезни животного,
вакцинация и клинические симптомы.
