Принцип анализа

Этот новый in vitro тест для определения аллерген-специальных IgE в сыворотки крови основан на принципе иммоно-анализа с аллергенами нанесённых на мембрану и при применение биотинилированных моноклональных антител к IgE собаки. Во время инкубирования с сывороткой, присоединяются аллерген-специальные IgE-молекулы на соответствующие аллергены. В конце при промывки определяют биотинулированные анитела присоединённые IgE и реагируют во время следующей инкубации с стрептавидин-конъюгат-щелочной фосфатазой. После промывки и добавления субстрата (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфата и нитроголубого тетразолия) образуется за счёт активности фосфатазы цветной осадок. Количество осадка прямо пропорционально концентрации специального IgE в исследуемой сывороткe.

Преимуществo метода - это определение 20 аллергенов за один раз с минимальным количеством 0,25 мл сыворотки, индивидуальная стадартная кривая и высокая чувствительность к высокой концентрации аллергенов, которые в виде тонких линий нанесeнны на мембрану.

Находящиеся в наборе реагенты

Все не открытые реагенты при правильном хранение (2-8°C) стабильны до истечения срока годности.

·     Polycheck Allergie кассеты (24 кассеты):  На каждую мембрану нанесенно 20 аллергенов и 5 стандартов.

·     Стартовый раствор (1 баночка, 7 мл, готов к применению), буферный раствор белков

·     Антитела (1 баночка, 7 мл, готов к применению): биотинилированныe моноклональные антитела к IgE собаки в растворе белка.

·     Стрептавидин-конъюгат (1 баночка, 7 мл, готов к применению): cтрептавидин-конъюгат с щелочной фосфатазой.

·     Раствор субстрата (1 баночка, 7 мл, готов к применению): 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфата и нитроголубого тетразолия как субстрат для щелочной фосфатазы.

·     Промывающий буфер (1 пакетик):  сухой порошок из буфера + добавки для промывки мембраны.

    

 

Необходимые материалы, не входящие в набор

·     Пипетка (200 - 1000 мкл)

·     Шейкер

·     Персональный компьютор, сканер и специальная программа (имеется у производителя)

Меры предосторожности

·     Реагенты из разных партий, не следует смешивать.

·     Растворы не пипетироать ртом.

·     Все рекомендованные меры предосторожности, при работе с потенциально инфекционным материалом, должны быть учтены.

 

Порядок проведения теста

 

Общее:

·       Реактивы при выполнение теста должны иметь комнатную температуру.

·       Тест проводить без перерыва.

·       Не допускать высыхание мембраны во время теста!

·       Пипетировать реактивы в зазор между  мембраной и углублением кассеты.

 

1.      Мембрану смочить промывочным буфером и отстучать на бумажную салфетку.

2.      Внести на мембрану 250 мкл стартового раствора и 5 мин. инкубировать. Отстучать осторожно на бумажной салфетке.

3.      Внести на мембрану 200 мкл сыворотки и 60 мин. инкубировать при комнатной температуре и при постоянном покачивание 1000 rpm или 30 rpm  на шейке. Остатки удалить, мембрану промыть 3 раза 1 мл промывочным буфером, отстучать осторожно на бумажной салфетке.

4.      Внести на мембрану 250 мкл  промывочного буфера и 5 мин. инкубировать при комнатной температуре и при постоянном покачивание 1000 rpm или 30 rpm  на шейке. Мембрану как в пункте 3 промыть.

5.      Внести 250 мкл антитела в углубление кассеты. 90 мин. инкубировать при комнатной температуре  и при постоянном покачивание 1000 rpm или 30 rpm  на шейке. Мембрану как в пункте 3 промыть.

6.      Внести 250 мкл стрептавидин-конъюгат в углубление кассеты. 20 мин. инкубировать при комнатной температуре и при  постоянном покачивание 1000 rpm или 30 rpm на шейке. Мембрану как в пункте 3 промыть.

7.      Внести 250 мкл раствора субстрата в углубление кассеты. В темноте (например, накрыть светонепропускаемой бумагой или крышкой) 20 мин. инкубировать при комнатной температуре и при  постоянном покачивание 1000 rpm или 30 rpm на шейке. Мембрану как в пункте 3 промыть.

        (Общее время 200 минут)

8.      Мембрана должна хорошо просохнуть. Оценка результатов описанна ниже.

 

 

 

 

 

Оценка результатов

Компьютор, сканер и специальная программа необходима для оценки результатов:

Кассету положить на сканер, сосканировать и задокументировать. Программа анализирует и производит расчёт данных. Программа вычисляет при сравнение с калибровочной кривой количество аллерген-специальных IgE для каждого аллергена (см. таб.1)

 

Tаб.1 Пять классов аллергических реакций

 

IgE-концентрация (kU/l)                      класс

 

                  < 1.0                                                0

             1.0 – 2.0                                               1

             2.0 – 20                                                2

                   > 20                                              3,4

 

 

Панель аллергенов

 

Polycheck- ветеринарная панель содержит 15 аллергенов и 5 аллерген-смесей:

 

·       Пыльца                                                                                                                     

·       Пылевые клещи (лат. мн. Acarina)

·       Пищевые клещи (лат. мн. Acarina)

·       Грибы плесени

·       Гриб Malassezia, Блоха                                                                                                                       

 

      
                          БОЛЕЕ ПОДРОБНУЮ ИНФОРМАЦИЮ , МОЖНО УЗНАТЬ НА САЙТЕ:
                                                                          http://amigovet.ru